Оборудование для ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой один из методов молекулярной биологии, результатом которого является многократное повышение содержания интересующего фрагмента ДНК в пробе. В настоящее время ПЦР используется для диагностики инфекций, выявления наследственных заболеваний, в криминалистике, в персонифицированной медицине. ПЦР оборудование для научных лабораторий – необходимый инструмент при клонировании, секвенировании, мутагенезе и др.

Как правило, проведение ПЦР заключается в выполнении 20-35 циклов, каждый из которых включает 3 стадии: денатурация, отжиг и элонгация. На первом этапе двуцепочечную матрицу ДНК нагревают до температуры 94-98 °C в течение 0,5-2 мин для денатурации. Далее на этапе отжига происходит связывание праймеров – коротких синтетических одноцепочечных фрагментов ДНК, комплиментарных участкам одной из цепей ДНК (в ходе реакции амплифицируется участок ДНК, ограниченный парой праймеров).

Температура отжига зависит от нуклеотидного состава праймеров, время продолжительности данного этапа составляет 30 сек.
Далее на стадии элонгации происходит репликация участка цепи ДНК между двумя праймерами с участием фермента ДНК-полимеразы. Для работы наиболее распространенных типов полимераз – Taq и Pfu – оптимальной является температура 72 °C. Продолжительность стадии определяется типом ДНК-полимеразы, и также зависит от длины фрагмента амплификации.

Увеличение копий ДНК-фрагмента происходит в геометрической прогрессии. Однако истощение компонентов в смеси, образование побочных продуктов, присутствие ингибиторов приводит к замедлению роста и выходу на плато.

Для поддержания определенной температуры в течение заданного времени на каждой стадии используют ПЦР-амплификаторы.

Современные приборы оснащены элементами Пельтье нового поколения, позволяющими увеличивать температуру блока с образцами со скоростью 7,5 °С/сек, что приводит к существенному снижению времени постановки ПЦР-эксперимента. При этом точность периодического охлаждения и нагревание пробирок, обычно не менее 0,1 °C. Кроме того, для предупреждения испарения образца и его конденсации в большинстве современных ПЦР-амплификаторов предусмотрена крышка с подогревом.
Способность амплификатора поддерживать температуру 4 °С после окончания ПЦР-реакции позволяет сохранять образцы длительное время (в течение ночи).

В настоящее время разработаны модификации ПЦР оборудования, способные удовлетворить разнообразные требования пользователя.

Вкратце рассмотрим основные из них.

• Так, градиентная ПЦР позволяет оптимально подобрать температуру отжига праймеров для эффективного синтеза фрагмента ДНК. Такая ПЦР возможна при наличии в амплификаторе блока с температурным градиентом. При этом несколько нагревательных элементов Пельтье на термоблок позволяют одновременно создавать несколько зон с различными температурами, и проводить ПЦР-реакции с разными параметрами цикла. ПЦР с горячим стартом используется для предотвращения синтеза неспецифических фрагментов за счет активности полимеразы при комнатной температуре. Это достигается за счет использования полимеразы, связанной с антителами, которые блокируют ее активность. Антитела высвобождаются из комплекса только при нагревании (на первой стадии ПЦР).

• ПЦР с обратной транскрипцией позволяет использовать в качестве матрицы молекулу РНК. ПЦР в реальном времени за счет использования флуоресцентных красителей дает возможность оценить количество копий, а также рассчитать сколько было матрицы. Мультиплексная ПЦР позволяет выявлять несколько последовательностей в одном образце путем использования нескольких пар праймеров.

На нашем сайте представлены приборы для ПЦР-амплификации, отвечающие всем современным требованиям.