Разрушение клеток: обработка ультразвуком VS гомогенизация
Подготовка образцов для анализа белков и нуклеиновых кислот требует обязательного выполнения двух основных этапов: разрушения ткани для высвобождения отдельных клеток и лизиса этих клеток для высвобождения их клеточного содержимого. Механическая гомогенизация и обработка ультразвуком (иногда называемая ультразвуковой гомогенизацией) являются двумя основными методами для этих процессов.
Выбор правильной техники для конкретного применения заслуживает тщательного анализа. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки, и лаборатории часто предпочитают использовать эти методы в сочетании друг с другом. Данная статья поможет выбрать метод, позволяющий избежать повреждения ценных или незаменимых образцов тканей.
Механическая гомогенизация
Механическая гомогенизация использует прямую физическую силу для приведения биологического образца в растворе в состояние однородного распределения, чтобы молекулярный состав всех фракций был одинаковым. Традиционно механическое разрушение достигалось замораживанием тканей, а затем их измельчением в ступке пестиком. В настоящее время существует два других распространенных метода: разрушение на основе шариков и разрушение ротор-статор. Эти методы разделения эффективно гомогенизируют образцы, но часто требуют последующего фракционирования для получения желаемой концентрации или чистоты молекул.
Шарики внутри микропробирок создают эффект сдвига на высоких скоростях. Образцы семян, тканей и растений: до и после. (Эталонное научное исследование)
При гомогенизации на основе шариков используются пластиковые или металлические шарики в сочетании с высокоскоростным встряхиванием для создания сил сдвига. Этот метод хорошо подходит для целых животных, насекомых (например, Drosophila melanogaster) или образцов растений, которые требуют разрушения крепких клеточных стенок. Недостатком разрушения на основе шариков является то, что он требует правильного выбора материала и диаметра шариков. Например, некоторые пластиковые шарики легко связываются с ДНК, высвобождая ее из раствора, когда их удаляют. Точно так же диаметр шарика может влиять на величину создаваемой силы и степень разрушения образца. Использование слишком большого или слишком маленького размера гранул может привести к неполной гомогенизации. К счастью, многие производители инструментов разработали множество шариков, подходящих для большинства задач гомогенизации.
Разрушение ротор-статор предполагает использование неподвижного статора с быстро движущимся ротором. Движение тканей и клеток в пространстве между ротором и статором создает большую силу сдвига. Эти устройства, как правило, ручные, а крепление ротор-статор взаимозаменяемо. Эти устройства эффективно разрушают жесткие ткани животных и растений (например, мышцы). Одним из существенных преимуществ разрыва ротор-статор является возможность постепенного увеличения степени гомогенизации за счет последовательной обработки с меньшим расстоянием между ротором и статором. Этот процесс может эффективно гомогенизировать даже самые эластичные образцы. Кроме того, образцы очень большого объема могут быть обработаны с использованием более крупного оборудования для разрушения. Недостатки разрыва ротор-статор включают повышенную стоимость и более громоздкое управление. Насадки часто требуют мытья и стерилизации перед повторным использованием. Предлагаются одноразовые насадки, но с более высокими эксплуатационными расходами.
Как ванны, так и ультразвуковые зонды используют высокоэнергетические звуковые волны для разрушения образцов. Обработка ультразвуком зонда является наиболее часто используемым процессом для разрушения клеток. Обработка ультразвуком в ванне полезна для больших партий препаратов тканей и клеток.
При работе с цельными тканями используйте тип ткани, чтобы определить, является ли только соникация возможным методом для эффективного разрушения. Более упругие ткани, такие как мышцы, требуют предварительного, первичного разрушения, например, смешивания, моментального замораживания или механической гомогенизации. Следует также отметить, что обработка целых животных и некоторых растительных тканей не может быть осуществлена только с помощью соникации. Таким образом, хотя соникация эффективно и быстро разрушает клетки в растворе и многие ткани, она не может быть использована для некоторых исходных материалов.
Ультразвуковая гомогенизация
Ультразвуковая гомогенизация — это высокоэнергетический процесс, и операторы рискуют изменить молекулярный состав раствора во время обработки ультразвуком. Пользователи должны указать частоту и мощность процесса. Нуклеиновые кислоты, в частности, чувствительны к силам сдвига при обработке ультразвуком. Если образец обрабатывается со слишком высокой частотой, остов ДНК/РНК разрывается, и анализ становится невозможным. Восприимчивость нуклеиновых кислот к сдвигу также может принести пользу операторам. Если желаемым конечным продуктом является белок, пользователи захотят удалить ДНК в растворе. Ультразвук может эффективно разрушать геномные и клеточные нуклеиновые кислоты, чтобы они больше не мешали очистке белков. Наконец, высокая энергия, создаваемая ультразвуком, может нагревать образцы и приводить к денатурации белков (если образец обрабатывается в течение длительного времени). Таким образом, необходимо помнить о продолжительности, мощности и частоте, используемых для ультразвуковой гомогенизации.
Гомогенизация тканей и клеток является распространенным методом, используемым для облегчения дальнейшего последующего анализа. Для этих процессов предлагается множество методов и инструментов. Механическая гомогенизация и ультразвуковая гомогенизация являются двумя широко используемыми методами. У каждого есть свои преимущества и недостатки. Много раз исследователи использовали эти два метода вместе, чтобы получить наиболее желаемый результат.