CRISPR / Cas9

Мир постоянно движется в направлении развития более качественного здравоохранения для всех живых существ, что требует более эффективных способов изучения заболеваний и биомедицинских проблем. К таким способам относятся исследования генетически модифицированных животных, над которыми уже много лет работают ученые Мюнхенского технического университета (МТУ) под руководством Бенджамина Шуссера, Ангелики Шнике, Кристиана Купатта и Бенедикта Кауфера.

Они создали здоровых и способных к размножению трансгенных животных – свиней и цыплят, которые конститутивно экспрессируют Cas9 во всех органах. Это позволяет редактировать геном in vivo в конкретных органах и тканях без необходимости получения модифицированных зародышевой линией животных, что является довольно трудоемкой и длительной задачей.

CRISPR/ Cas9 – это метод редактирования генов, который используется для изменения геномов живых организмов. CRISPR – это семейство повторяющихся последовательностей ДНК, первоначально найденных в бактериях, которые транскрибируются и обрабатываются до гРНК, чтобы привести Cas9 к определенной последовательности ДНК. Эта система была адаптирована исследователями для непосредственной доставки гРНК с определенной последовательностью. Путем доставки нуклеазы Cas9 вместе с направляющей РНК (гРНК) в клетку можно разрезать геном клетки в нужном месте, что позволяет удалить существующие гены и добавить новые. Существует также возможность просто включать и выключать гены.

"Этот проект связан с нашей предыдущей работой. Мы заинтересованы в создании генетически модифицированных свиней и кур для биомедицинских и сельскохозяйственных исследований", - говорит профессор Бенджамин Шуссер.

До сих пор исследования проводились в основном на мышах, поскольку изучение крупных животных оказалось довольно сложным. Хотя другие животные, например свиньи, более похожи по своей физиологии на человека. Кроме того, изучение видов, сильно отличающихся от человека, таких как куры, позволяет получить мощное представление о фундаментальных биологических и биомедицинских процессах.

Профессор Шуссер объясняет: "До сих пор редактирование генома в конкретном органе или ткани живого животного было серьезной проблемой. Приходилось либо создавать сложные генетические модели животных (условное нацеливание генов), что достаточно дорого и требует много времени в животноводстве. Или же направляющие РНК должны были быть введены вместе с нуклеазой Cas9, где размер нуклеазы Cas9 и ограничивающая способность вирусных векторов переноса является основным препятствием, что делает процесс очень неэффективным".

Они нашли инновационный и эффективный способ устранить эту проблему, создав животных, которые уже экспрессируют Cas9 и требуют только введения направляющих РНК, которые гораздо меньше, и поэтому их легче вводить.

Cas9-трансгенные свиньи были получены путем целенаправленного введения Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) в локус ROSA26, который является безопасным местом для экспрессии трансгенов без прерывания функции важных генов. Cas9-трансгенные цыплята были получены путем опосредованной интегразой phiC31 интеграции экспрессионной конструкции SpCas9 в куриный псевдо-сайт attP.

Число копий трансгена было определено у обоих видов с помощью капельной цифровой ПЦР и выявило одну копию SpCas9 у свиней и кур. Как Cas9-трансгенные куры, так и свиньи развивались нормально и были фертильными.

Функциональность трансгена SpCas9 in vivo и in vitro была продемонстрирована с использованием различных методов доставки гРНК, таких как трансфекция синтетическими гРНК, электропорация in ovo или вирусные методы доставки. Хотя все подходы приводили к редактированию целевого локуса, эффективность зависела от метода доставки гРНК, варьируя от 8% in vivo до 70% инактивации гена in vitro. Эти эксперименты показали, что можно эффективно инактивировать целевые гены или удалять большие сегменты генов точным и органоспецифичным образом.

"В сельском хозяйстве широкогеномные исследования могут дать представление о том, какие гены или SNPs/полиморфизмы могут быть вовлечены в формирование таких признаков, как устойчивость к болезням или жаре. Cas9 свиней и цыплят теперь позволяет проверить это непосредственно на животном. Кроме того, можно использовать механизм системы CRISPR/Cas9 для борьбы с инфекциями, вызванными ДНК-вирусами. Например, первые работы в культуре клеток уже показали уничтожение вируса болезни Марека, вируса герпеса домашней птицы. В фундаментальных и биомедицинских исследованиях мы можем вводить или исправлять мутации конкретно в нужном органе без необходимости создавать новые модели животных для каждого целевого гена. Это также сокращает количество экспериментальных животных", - говорит профессор Бенджамин Шуссер. Он добавляет, что эти животные могут быть предоставлены в распоряжение других исследовательских групп, тем самым продвигая биомедицинские и сельскохозяйственные исследования на международном уровне благодаря эффективному редактированию генома у живых животных.